Il veleno di serpente contiene enzimi che idrolizzano i legami di esteri carbossilici.I substrati per l'idrolisi sono fosfolipidi, acetilcolina e acetato aromatico.Questi enzimi includono tre tipi: fosfolipasi, acetilcolinesterasi ed esterasi aromatica.L'esterasi di arginina nel veleno di serpente può anche idrolizzare l'arginina sintetica o la lisina, ma in natura idrolizza principalmente i legami peptidici proteici, quindi appartiene alla proteasi.Gli enzimi discussi qui agiscono solo su substrati esteri e non possono agire su alcun legame peptidico.Tra questi enzimi, le funzioni biologiche dell'acetilcolinesterasi e della fosfolipasi sono più importanti e sono state ampiamente studiate.Alcuni veleni di serpente hanno una forte attività esterasi aromatica, che può idrolizzare p-nitrofenil etil estere, a - o P-naftalene acetato e indolo etil estere.Non è ancora noto se questa attività sia prodotta da un enzima indipendente o da un noto effetto collaterale della carbossilesterasi, per non parlare del suo significato biologico.Quando il veleno di Agkistrodon halys Japonicus è stato fatto reagire con p-nitrofenil etil estere e indolo etil estere, gli idrolizzati di p-nitrofenolo e indolo fenolo non sono stati trovati;Al contrario, se questi esteri reagiscono con il veleno di serpente della sottospecie di cobra Zhoushan e con il veleno di serpente di Bungarus multicinctus, verranno rapidamente idrolizzati.È noto che questi veleni di cobra hanno una forte attività colinesterasica, che può essere responsabile dell'idrolisi dei suddetti substrati.Infatti, Mclean et al.(1971) hanno riferito che molti veleni di serpente appartenenti alla famiglia Cobra possono idrolizzare indolo etil estere, naftalene etil estere e butil naftalene estere.Questi veleni di serpente provengono da: cobra, cobra dal collo nero, cobra dalle labbra nere, cobra dorato, cobra egiziano, cobra reale, cobra dorato mamba, mamba nero e mamba dalle labbra bianche (D. aw conosce ancora il serpente a sonagli rombola orientale
Il veleno di serpente può idrolizzare il metil indolo etil estere, che è il substrato per determinare l'attività della colinesterasi nel siero, ma questo veleno di serpente non mostra attività della colinesterasi.Ciò dimostra che esiste un'esterasi sconosciuta nel veleno di cobra, che è diversa dalla colinesterasi.Per comprendere la natura di questo enzima, è necessario un ulteriore lavoro di separazione.
1, fosfolipasi A2
(I) Panoramica
La fosfolipasi è un enzima in grado di idrolizzare il gliceril fosfato.Esistono 5 tipi di fosfolipasi in natura, vale a dire la fosfolipasi A2 e la fosfolipasi
A. , fosfolipasi B, fosfolipasi C e fosfolipasi D. Il veleno di serpente contiene principalmente fosfolipasi A2 (PLA2), alcuni veleni di serpente contengono fosfolipasi B e altre fosfolipasi si trovano principalmente nei tessuti animali e nei batteri.La Fig. 3-11-4 mostra il sito di azione di queste fosfolipasi sull'idrolisi del substrato.
Tra le fosfolipasi, PLA2 è stato studiato di più.Potrebbe essere l'enzima più studiato nel veleno di serpente.Il suo substrato è il legame estere sulla seconda posizione di Sn-3-glicerofosfato.Questo enzima è ampiamente presente nel veleno di serpente, nel veleno d'api, nel veleno di scorpione e nei tessuti animali, e il PLA2 è abbondante nei veleni di serpente di quattro famiglie.Poiché questo enzima rompe i globuli rossi e causa l'emolisi, è anche chiamato "emolisina".Alcune persone chiamano anche lecitinasi emolitica PLA2.
Ludeeke ha scoperto per primo che il veleno di serpente può produrre un composto emolitico agendo sulla lecitina attraverso gli enzimi.Successivamente, Delezenne et al.ha dimostrato che quando il veleno di cobra agisce sul siero di cavallo o sul tuorlo, forma una sostanza emolitica.È ormai noto che la PLA2 può agire direttamente sui fosfolipidi della membrana eritrocitaria, distruggendo la struttura della membrana eritrocitaria e provocando un'emolisi diretta;Può anche agire sul siero o sulla lecitina aggiunta per produrre lecitina emolitica, che agisce sui globuli rossi per produrre emolisi indiretta.Sebbene il PLA2 sia abbondante nelle quattro famiglie di veleni di serpente, il contenuto di enzimi in vari veleni di serpente è leggermente diverso.serpente a sonagli (c
Il veleno di serpente ha mostrato solo una debole attività PLA2.La tabella 3-11-11 illustra il confronto dell'attività PLA2 di 10 principali veleni di serpenti velenosi in Cina.
Tabella 3-11-11 Confronto delle attività della fosfolipasi VIII di 10 veleni di serpente in Cina
Veleno di serpente
Rilascio di grasso
acido alifatico,
Cjumol/mg)
Attività emolitica CHU50/^ g * ml)
Veleno di serpente
Rilasciare gli acidi grassi
(^raol/mg)
Attività emolitica” (HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
undici
Ofis micracefalo
cinque virgola uno zero
kalyspallas
8. 68
duemilaottocento
gracile
V, acuto
7. 56
* * #
Ofiofago hannah
tre virgola otto due
centoquaranta
Bnugarus fasctatus
7,56
duecentottanta
B. multicintus
uno virgola nove sei
duecentottanta
Vipera a russelli
sette virgola zero tre
T, mucosquamato
uno virgola otto cinque
Siamensis
T. stejnegeri
0.97
(2) Separazione e purificazione
Il contenuto di PLA2 nel veleno di serpente è elevato ed è stabile al calore, agli acidi, agli alcali e ai denaturanti, quindi è facile purificare e separare il PLA2.Il metodo comune consiste nell'effettuare prima la filtrazione su gel sul veleno grezzo, quindi eseguire la cromatografia a scambio ionico e il passaggio successivo può essere ripetuto.Va notato che la liofilizzazione della PLA2 dopo la cromatografia a scambio ionico non dovrebbe causare aggregazione, poiché il processo di liofilizzazione spesso aumenta la forza ionica nel sistema, che è un fattore importante che causa l'aggregazione della PLA2.Oltre ai suddetti metodi generali, sono stati adottati anche i seguenti metodi: ① Wells et al.② L'analogo del substrato di PLA2 è stato utilizzato come ligando per la cromatografia di affinità.Questo ligando può legarsi a PLA2 nel veleno di serpente con Ca2+.L'EDTA è usato principalmente come eluente.Dopo che il Ca2+ è stato rimosso, l'affinità tra PLA2 e il ligando diminuisce e può essere dissociato dal ligando.Altri usano una soluzione organica al 30% o 6mol/L di urea come eluente.③ La cromatografia idrofobica è stata eseguita con PhiiylSephar0SeCL-4B per rimuovere la traccia di PLA2 nella cardiotossina.④ L'anticorpo anti PLA2 è stato utilizzato come ligando per eseguire la cromatografia di affinità su PLA2.
Finora, un gran numero di PLAZ dal veleno di serpente è stato purificato.Tu et al.(1977) elencarono il PLA2 purificato dal veleno di serpente prima del 1975. Negli ultimi anni, ogni anno è stato riportato un gran numero di articoli sulla separazione e la purificazione del PLA2.Qui, ci concentriamo sulla separazione e purificazione del PLA da parte di studiosi cinesi.
Chen Yuancong et al.(1981) hanno separato tre specie di PLA2 dal veleno di Agkistrodon halys Pallas nello Zhejiang, che possono essere suddivise in PLA2 acide, neutre e alcaline in base ai loro punti isoelettrici.Secondo la sua tossicità, la PLA2 neutra è più tossica, che è stata identificata come neurotossina presinaptica Agkistrodotossina.La PLA2 alcalina è meno tossica e la PLA2 acida non ha quasi nessuna tossicità.Wu Xiangfu et al.(1984) hanno confrontato le caratteristiche di tre PLA2, tra cui peso molecolare, composizione aminoacidica, N-terminale, punto isoelettrico, stabilità termica, attività enzimatica, tossicità e attività emolitica.I risultati hanno mostrato che avevano un peso molecolare e una stabilità termica simili, ma presentavano differenze significative in altri aspetti.Sotto l'aspetto dell'attività enzimatica, l'attività enzimatica acida era superiore all'attività enzimatica alcalina;L'effetto emolitico dell'enzima alcalino sui globuli rossi del ratto era il più forte, seguito dall'enzima neutro e dall'enzima acido appena emolizzato.Pertanto, si ipotizza che l'effetto emolitico del PLAZ sia correlato alla carica della molecola PLA2.Zhang Jingkang et al.(1981) hanno realizzato cristalli di Agkistrodotossina.Tu Guangliang et al.(1983) hanno riferito che un PLA tossico con un punto isoelettrico di 7,6 è stato isolato e purificato dal veleno di Vipera rotundus del Fujian, e le sue proprietà fisiche e chimiche, la composizione degli amminoacidi e la sequenza di 22 residui di amminoacidi al N -terminale sono stati determinati.Li Yueseng et al.(1985) hanno isolato e purificato un'altra PLA2 dal veleno di Viper rotundus nel Fujian.La subunità del PLA2 * è 13 800, il punto isoelettrico è 10,4 e l'attività specifica è 35/xnioI/miri mg. Con la lecitina come substrato, il pH ottimale dell'enzima è 8,0 e la temperatura ottimale è 65 ° C LD5 iniettato per via endovenosa nei topi.È 0,5 ± 0,12 mg/kg.Questo enzima ha evidenti effetti anticoagulanti ed emolitici.La molecola tossica PLA2 è composta da 123 residui di 18 tipi di amminoacidi.La molecola è ricca di cisteina (14), acido aspartico (14) e glicina (12), ma contiene solo una metionina e il suo N-terminale è il residuo di serina.Rispetto alla PLA2 isolata da Tuguang, il peso molecolare e il numero di residui di amminoacidi dei due isoenzimi sono molto simili e anche la composizione di amminoacidi è molto simile, ma il numero di residui di acido aspartico e prolina è leggermente diverso.Il veleno del serpente cobra reale del Guangxi contiene un ricco PLA2.Shu Yuyan et al.(1989) hanno isolato dal veleno una PLA2, che ha un'attività specifica 3,6 volte superiore al veleno originale, un peso molecolare di 13000, una composizione di 122 residui aminoacidici, un punto isoelettrico di 8,9 e una buona stabilità termica.Dall'osservazione al microscopio elettronico dell'effetto del PLA2 basico sui globuli rossi, si può vedere che ha effetti evidenti sulla membrana dei globuli rossi umani, ma non ha alcun effetto evidente sui globuli rossi di capra.Questo PLA2 ha un evidente effetto di ritardo sulla velocità elettroforetica dei globuli rossi negli esseri umani, capre, conigli e porcellini d'India.Chen et al.Questo enzima può inibire l'aggregazione piastrinica indotta da ADP, collagene e acido arachidonico di sodio.Quando la concentrazione di PLA2 è 10/xg/ml~1OOjug/ml, l'aggregazione piastrinica è completamente inibita.Se le piastrine lavate fossero utilizzate come materiali, il PLA2 non potrebbe inibire l'aggregazione alla concentrazione di 20 Mg/ml.L'aspirina è un inibitore della cicloossigenasi, che può inibire l'effetto della PLA2 sulle piastrine.La PLA2 può inibire l'aggregazione piastrinica idrolizzando l'acido arachidonico per sintetizzare il trombossano A2.La conformazione della soluzione di PLA2 prodotta dal veleno di Agkistrodon halys Pallas nella provincia di Zhejiang è stata studiata mediante dicroismo circolare, fluorescenza e assorbimento UV.I risultati sperimentali hanno mostrato che la conformazione della catena principale di questo enzima era simile a quella dello stesso tipo di enzima di altre specie e generi, la conformazione dello scheletro aveva una buona resistenza al calore e il cambiamento strutturale nell'ambiente acido era reversibile.La combinazione dell'attivatore Ca2+ e dell'enzima non influenza l'ambiente dei residui di triptofano, mentre l'inibitore Zn2+ fa il contrario.Il modo in cui il valore del pH della soluzione influisce sull'attività enzimatica è diverso dai reagenti di cui sopra.
Nel processo di purificazione PLA2 del veleno di serpente, un fenomeno ovvio è che un veleno di serpente contiene due o più picchi di eluizione PLA2.Questo fenomeno può essere spiegato come segue: ① a causa dell'esistenza di isoenzimi;② Un tipo di PLA2 viene polimerizzato in una varietà di miscele di PLA2 con vari pesi molecolari, la maggior parte dei quali sono compresi tra 9 000 e 40 000;③ La combinazione di PLA2 e altri componenti del veleno di serpente complica il PLA2;④ Poiché il legame ammidico in PLA2 è idrolizzato, la carica cambia.① E ② sono comuni, con solo poche eccezioni, come PLA2 nel veleno di serpente CrWa/w
Ci sono due situazioni: ① e ②.La terza condizione è stata trovata in PLA2 nel veleno dei seguenti serpenti: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, Vipera palestinese, Vipera delle sabbie e Terribile serpente a sonagli km.
Il risultato del caso ④ fa cambiare la velocità di migrazione della PLA2 durante l'elettroforesi, ma la composizione dell'amminoacido non cambia.I peptidi possono essere rotti per idrolisi, ma generalmente sono ancora legati insieme da legami disolfuro.Il veleno del serpente a sonagli orientale contiene due forme di PLA2, chiamate rispettivamente tipo a e tipo p PLA2.La differenza tra questi due tipi di PLA2 è solo un amminoacido, cioè la glutammina in una molecola di PLA2 è sostituita dall'acido glutammico nell'altra molecola di PLA2.Sebbene la ragione esatta di questa differenza non sia chiara, si ritiene generalmente che sia correlata alla deaminazione del PLA2.Se il PLA2 nel veleno di vipera palestinese viene mantenuto caldo con il veleno grezzo, i gruppi terminali nelle sue molecole enzimatiche diventeranno più numerosi di prima.Da C PLA2 isolato dal veleno di serpente ha due diversi N-terminali e il suo peso molecolare è 30000. Questo fenomeno può essere causato dal dimero asimmetrico di PLA2, che è simile al dimero simmetrico formato da PLA2 nel veleno del serpente a sonagli diamondback orientale e serpente a sonagli diamondback occidentale.Il cobra asiatico è composto da molte sottospecie, alcune delle quali non sono molto definite nella classificazione.Ad esempio, quella che era chiamata la sottospecie Cobra Outer Caspian è ora riconosciuta
Dovrebbe essere attribuito al cobra esterno del Mar Caspio.Poiché esistono molte sottospecie e sono mescolate tra loro, la composizione del veleno di serpente varia notevolmente a causa delle diverse fonti e anche il contenuto di isoenzimi PLA2 è elevato.Ad esempio, veleno di cobra
Sono stati trovati almeno 9 tipi di isoenzimi PLA2 di r ^ ll specie e 7 tipi di isoenzimi PLA2 sono stati trovati nel veleno della sottospecie di cobra Caspian.Durkin et al.(1981) hanno studiato il contenuto di PLA2 e il numero di isoenzimi in diversi veleni di serpente, inclusi 18 veleni di cobra, 3 veleni di mamba, 5 veleni di vipera, 16 veleni di serpente a sonagli e 3 veleni di serpente di mare.In generale, l'attività PLA2 del veleno di cobra è elevata, con molti isoenzimi.L'attività PLA2 e gli isoenzimi del veleno di vipera sono medi.L'attività PLA2 del veleno di mamba e del veleno di serpente a sonagli è molto bassa o nessuna attività PLA2.Anche l'attività PLA2 del veleno di serpente di mare è bassa.
Negli ultimi anni, non è stato riportato che il PLA2 nel veleno di serpente esista sotto forma di dimero attivo, come il serpente a sonagli rhombophora orientale (il veleno di serpente C. contiene PLA2 di tipo a e di tipo P, entrambi composti da due subunità identiche , e solo la dimerasi ha
Attività.Shenn et al.ha anche proposto che solo il dimero di PLA2 del veleno di serpente sia la forma attiva dell'enzima.Lo studio della struttura spaziale dimostra anche che il PLA2 del serpente a sonagli diamondback occidentale esiste sotto forma di dimero.Composto piscivoro
Esistono due diversi PLA ^ Ei ed E2 di veleno di serpente, in cui 仏 esiste sotto forma di dimero, il dimero è attivo e il suo monomero dissociato è inattivo.Lu Yinghua et al.(1980) hanno studiato ulteriormente le proprietà fisiche e chimiche e la cinetica di reazione di E. Jayanthi et al.(1989) hanno isolato un PLA2 basico (VRVPL-V) dal veleno di vipera.Il peso molecolare del monomero PLA2 è 10000, che ha effetti letali, anticoagulanti ed edema.L'enzima può polimerizzare polimeri con pesi molecolari diversi nelle condizioni di PH 4,8 e il grado di polimerizzazione e il peso molecolare dei polimeri aumentano con l'aumento della temperatura.Il peso molecolare del polimero generato a 96 ° C è 53 100 e l'attività PLA2 di questo polimero aumenta di due
Tempo di pubblicazione: 18 novembre 2022